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    广西11选5全年开奖历史记录: 伪狂犬病毒疫苗的生产方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    广西11选5大小走势图 www.fnjpv.tw CN201310529245.9

    申请日:

    2013.10.31

    公开号:

    CN103550772B

    公开日:

    2015.01.14

    当前法律状态:

    有效性:

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 39/245申请日:20131031|||公开
    IPC分类号: A61K39/245; A61P31/22; C12N7/04; C12R1/93(2006.01)N 主分类号: A61K39/245
    申请人: 成都天邦生物制品有限公司
    发明人: 徐宏军; 胡来根; 任丽; 张奕强; 岳丰雄
    地址: 610000 四川省成都市龙泉驿经济技术开发区灵池路
    优先权:
    专利代理机构: 四川省成都市天策商标专利事务所 51213 代理人: 刘兴亮
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310529245.9

    授权公告号:

    103550772B||||||

    法律状态公告日:

    2015.01.14|||2014.03.12|||2014.02.05

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法,包括以下步骤:(1)取传代细胞系细胞,经消化传代,以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养;(2)将毒种用细胞维持液稀释10倍,接种细胞单层,收获感染细胞毒液,即为生产用毒种;(3)取步骤(1)中已形成的细胞单层,经消化制备为细胞悬液,接种于生物反应器中,在生物反应器中加入微载体;(4)对细胞进行接毒操作,所接入毒种为步骤(2)中生产的毒种;(5)待微载体上细胞全部脱落,且溶解氧值呈明显上升趋势,将反应器内液体连同微载体一起收获,置与-20℃条件下反复冻融2次,去除微载体及细胞碎片,制得伪狂犬病毒疫苗。本发明生产周期短、产量大。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,包括以下步骤:
    (1)制苗用细胞的传代与培养:取细胞培养瓶中生长良好的传代细胞系细胞,经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代,以细胞生长液在细胞培养瓶中继续培养,培养温度为37℃,形成细胞单层时,用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养;
    (2)制苗用毒种的繁殖:将毒种用DMEM细胞培养基配制的细胞维持液稀释10倍,接种细胞单层,培养48~72小时,当细胞病变达75%以上时,收获感染细胞毒液,即为生产用毒种;
    (3)传代细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)中已形成的细胞单层,经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液,按5×105/mL~5×106/mL的细胞密度接种于生物反应器中,在生物反应器中加入微载体,设定培养条件为:温度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和搅拌速度30~60转/分钟;
    (4)制苗毒液的繁殖:当细胞达到5×106/mL~5×107/mL后进行接毒操作,所接入毒种为步骤(2)中生产的毒种,接毒前用含有10ug/mL胰酶的病毒培养液将长满细胞的微载体洗涤2~4次,设定培养条件为:温度37℃、pH6.8~7.6、溶氧30%~60%和搅拌速度30~60转/分钟;
    (5)伪狂犬病毒疫苗的收获:待微载体上细胞全部脱落,且溶解氧值呈明显上升趋势,将反应器内液体连同微载体一起收获,置与-20℃条件下反复冻融2次,然后经离心或过滤去除微载体及细胞碎片,即制得伪狂犬病毒疫苗。

    2.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,步骤(1)中所述的传代细胞系为BHK-21细胞系、PK-15细胞系、IBRS-2细胞系、 Marc-145细胞系、Vero细胞系或ST细胞系。

    3.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧和搅拌速度参数的生物反应器,所述生物反应器的容积为3L~3000L。

    4.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述微载体为以交联葡聚糖为基质,用带有正电荷的N,N-二乙氨乙基基团进行取代的Cytodex系列微载体。

    5.  根据权利要求4所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述微载体在使用前需清洗、灭菌,具体方法为:用PBS浸泡微载体过夜,然后用PBS清洗微载体3遍,再用PBS浸泡微载体,121℃蒸汽灭菌30分钟,微载体经清洗、灭菌处理后,加入到已灭菌的生物反应器中,用高糖型DMEM清洗。

    6.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述EDTA-胰酶细胞分散液是由质量体积分数为0.25%的规格为1:250的胰酶、质量体积分数为0.02%的EDTA的Hank's液组成,所述规格1:250胰酶为每克胰酶中含有250个活力单位的胰蛋白酶。

    7.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述细胞生长液由重量分数90%~98%的DMEM液、重量分数2%~10%的牛血清及100~500单位/ml的抗菌素组成,所述细胞生长液pH为6.8~7.6。

    8.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述步骤(4)中的病毒培养液为含有胰酶的DMEM液,且DMEM液中含有100~500单位/ml的抗菌素,所述病毒培养液pH为6.8~7.6。

    9.  根据权利要求7或8所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述 抗菌素为青霉素钠和硫酸链霉素的混合物。

    10.  根据权利要求1所述伪狂犬病毒疫苗的生产方法,其特征在于,所述步骤(4)中的毒种接种量为0.01~0.5MOI。

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    狂犬病毒 疫苗 生产 方法
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