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    广西11选5计算器: A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    广西11选5大小走势图 www.fnjpv.tw CN201310175324.4

    申请日:

    2013.05.14

    公开号:

    CN103266091B

    公开日:

    2015.01.14

    当前法律状态:

    有效性:

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 7/01申请日:20130514|||公开
    IPC分类号: C12N7/01; C12N15/86; A61K39/135; A61P31/14; C12R1/93(2006.01)N 主分类号: C12N7/01
    申请人: 中国农业科学院兰州兽医研究所
    发明人: 刘湘涛; 郑海学; 杨帆; 靳野; 郭建宏; 曹伟军; 张克山; 田宏; 何继军; 董海聚; 才学鹏
    地址: 730046 甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号
    优先权: 2012.07.30 CN 201210266252.X
    专利代理机构: 北京鑫浩联德专利代理事务所(普通合伙) 11380 代理人: 吕爱萍
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310175324.4

    授权公告号:

    103266091B||||||

    法律状态公告日:

    2015.01.14|||2013.09.25|||2013.08.28

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种利用反向遗传操作技术制备的A型口蹄疫重组疫苗株及其制备方法和应用,一种是效价高、抗原匹配性和免疫?;ぢ矢叩腁型口蹄疫重组疫苗株,另一种是效价高、抗原匹配性、免疫?;ぢ矢咔叶运拗魑拗虏⌒缘腁型口蹄疫重组无致病性疫苗株,疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQIDNO:1所示,利用反向遗传操作系统能够拯救出病毒的真核质粒,用制备的重组疫苗株制成灭活苗,免疫猪和牛后可有效刺激机体产生免疫应答,并提供猪和牛体免疫?;ぷ饔?,对A型AISA拓扑型毒株的10000倍牛半数感染剂量(BID50)攻毒实验,免疫?;ぢ蚀?00%,50%?;ぜ亮浚≒D50)为10.81~13.59,可用于我国及其周边国家A型口蹄疫病毒的预防和控制。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种A型口蹄疫重组疫苗株,其特征在于:所述A型口蹄疫重组疫苗株具有高滴度、与流行病毒的抗原匹配性高,免疫?;ぢ矢叩奶卣?,该疫苗株的抗原核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示。

    2.   一种A型口蹄疫重组无致病性疫苗株,其特征在于:在上述A型口蹄疫重组疫苗株的基础上将L基因进行突变,所述A型口蹄疫重组无致病性疫苗株具有高滴度、与流行病毒的抗原匹配性高,免疫?;ぢ矢?、并且对猪和牛无致病性、不形成血毒症、不排毒,且能诱导宿主产生早期免疫应答等特征,该疫苗株的L基因序列为SEQ ID NO:2所示。

    3.   一种如权利要求1所述的A型口蹄疫重组疫苗株的制备方法,其特征在于:(1)、A型口蹄疫重组疫苗株真核转录质粒的构建,该真核转录质粒在病毒全长cDNA两侧嵌有榔头锤酶(hammerhead ribozyme,HamRz) 和戊型肝炎酶(hepatitis delta ribozyme,HdvRz),在其外侧的5'端添加有聚合酶I和聚合酶II转录启动子,在3'端有终止子;以O型口蹄疫病毒拯救系统为骨架,通过AflII和SgrAI限制性内切酶,用A/WH/CHA/09毒株含有部分L和P1基因的序列SEQ ID NO:1替换相应基因,得到prA?FMDV的重组质粒;所用A/WH/CHA/09毒株是2009年1月分离于湖北武汉,经BHK?21传代培养10代,保藏于农业部兽医局指定保存单位:国家口蹄疫参考实验室,使用RNAeasy Mini Kit提取A/WH/CHA/09毒株的总RNA,用引物oligNot I反转录合成病毒第一链cDNA,以合成的第一链cDNA为模板,用引物AP1?F和AP1?R扩增获得A/WH/CHA/09毒株部分L和P1的基因片段,上述三条针对A/WH/CHA/09株的特异性引物分别是:
    oligNot I: 5`?ttttctagagcggccgct38?3'
    AP1?F:5'?ttttccttaagggacaggaacatgctgtgtttgcctgcgt?3'
    AP1?R: 5'?tattttcaccggtgcaataattttctgcttgtgtctgt c?3',
    在以上的特异性引物中,扩增A/WH/CHA/09毒株部分L和P1基因序列所用上游引物AP1?F中含AflII限制性酶切位点;下游引物AP1?R中含下划线部分的SgrAI限制性酶切位点,用上述特异性引物进行扩增,得到A/WH/CHA/09毒株部分L和P1基因片段,大小为2400 bp,构建50μL反应体系,扩增条件为:94℃ 5min,94℃ 30s,57℃ 30s,68℃ 2min30s,go to 2,35个循环,72℃ 8min,PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳核实后进行纯化回收并送交测序,获得上述基因片段的DNA;
    prO/CHA/99是本实验室前期构建的含有O/CHA/99毒株全长cDNA的质粒,其中,O/CHA/99毒株是O型口蹄疫毒株,1999年分离于中国香港,现保存于国家口蹄疫参考实验室,prO/CHA/99质粒组成是在病毒基因组5'端上游含人巨细胞病毒RNA聚合酶II启动子及编码牛生长素多聚苷酸化信号的修饰剪切序列,在其两者间含鼠源RNA聚合酶I启动子;在病毒基因组3'端下游含鼠源聚合酶终止子I和聚合酶终止子II序列;及嵌合在O型口蹄疫病毒O/CHA/99全长cDNA基因组两端的榔头锤酶和戊型肝炎酶的核心序列,其中戊型肝炎酶共有88个核糖核酸,自我剪切修饰位点在5'末端G处;榔头锤酶核心序列共有58个核糖核酸,自我剪切修饰位点在3'末端C处,将含O型口蹄疫病毒O/CHA/99基因组的感染性克隆转染至受体细胞中,通过RNA聚合酶II启动子和RNA聚合酶I启动子调控元件分别转录包装出病毒RNA前体,再经HamRz 和HdvRz的修饰剪切产生具有感染性的病毒RNA,将O型口蹄疫病毒O/CHA/99株拯救系统的质粒prO/CHA/99与上述得到的A/WH/CHA/09毒株部分L和P1片段,分别用AflII和SgrAI双酶切后,连接转化至JM109感受态细胞中,测序鉴定阳性克隆,获得含A/WH/CHA/09毒株部分前导蛋白L和结构蛋白P1的重组质粒,将重组质粒命名为prA?FMDV,且仅位点1与流行毒株有差异;
    (2)、A型口蹄疫重组质粒prA?FMDV转染口蹄疫病毒敏感细胞,具体为BHK?21细胞或IBRS?2细胞,拯救获得所述的与流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重组病毒;该真核转录质粒在适应细胞、乳鼠和猪体内均能够拯救出相应病毒。

    4.   根据权利要求3所述的A型口蹄疫重组疫苗株的制备方法,其特征在于:用所述重组质粒prA?FMDV直接转染口蹄疫病毒敏感细胞BHK?21细胞或IBRS?2细胞,得到与流行毒株抗原匹配的A型口蹄疫重组病毒。

    5.   一种如权利要求2所述的A型口蹄疫重组无致病性疫苗株的制备方法,其特征在于:(1)、A型口蹄疫重组无致病性疫苗株真核转录质粒的构建,在上述重组质粒prA?FMDV的基础上,将L基因SAP区域(SAF?A/B, Acinus, and PIAS)突变,其构建过程是:将表达质粒pCDNA3.1(+)用特异性引物进行扩增,得到含有PacI和AflII酶切位点的基因片段,上述引物分别是:
    pCD?AflII?ApaI?F:5'?ttttccttaaggggcccgtttaaacccgctgat?3'
    pCD?PacI?NheI?R:5'?cttacttaattaagctagccagcttgggtctcccta?3'
    同时将重组质粒prA?FMDV,经PacI和AflII双酶切后,与上述得到的含有PacI和AflII酶切位点的pCDNA基因片段连接转化至JM109感受态细胞中,测序鉴定阳性克隆,获得含5’UTR和部分L基因的重组质粒,将重组质粒命名为pCD?OL;以鉴定正确的重组质粒pCD?OL为模板,用磷酸化突变引物F?P和SAP?P进行PCR扩增,上述5'磷酸化的点突变引物分别是:
    F?P:5'?gacctcacagggcttgaactgcacga?3'
    SAP?P:5'?ctccgcctgcttggcggctgcaagcgtg?3', 
    在以上的磷酸化的点突变引物中,将L基因中SAP区域进行突变,用此对引物进行平末端扩增,纯化回收PCR产物,经室温连接5min后,转化大肠杆菌JM109,测序鉴定点突变后的阳性克隆,将得到的定点突变重组质粒命名为pCD?OL?SAP;
    将已获得的重组质粒prA ?FMDV与上述得到的L基因中SAP区域进行突变后的重组质粒pCD?OL?SAP,分别用PacI和AflII双酶切后,连接转化至JM109感受态细胞中,测序鉴定阳性克隆,获得含A/WH/CHA/09毒株的P1基因和L基因中SAP区域突变的重组质粒,将重组质粒命名为prA?SAP?FMDV;
    (2)、A型口蹄疫重组无致病性疫苗株真核转录质粒prA?SAP?FMDV转染口蹄疫病毒敏感细胞,BHK?21细胞或IBRS?2细胞,拯救获得所述的与流行毒株抗原匹配且无致病性的A型口蹄疫重组病毒。

    6.   根据权利要求5所述的A型口蹄疫重组无致病性疫苗株的制备方法,其特征在于:在重组质粒prA?FMDV的基础上,对L基因的SAP进行突变,将重组质粒prA? SAP?FMDV直接转染口蹄疫病毒敏感的细胞BHK?21细胞或IBRS?2细胞,得到重组病毒rA?SAP?FMDV对猪和牛都没有致病性,并且不形成血毒症,不排毒,能够产生较强和较早的免疫应答。

    7.   一种根据权利要求1所述的A型口蹄疫重组疫苗株制成的疫苗,其特征在于:培养的A型口蹄疫重组疫苗株用二乙烯亚胺(Binary ethylenimine, BEI)灭活,浓缩纯化后与ISA206佐剂以1:1体积比混合制备疫苗,免疫猪和牛后有效刺激机体产生免疫应答,并提供猪和牛体免疫?;ぷ饔?,对A型AISA谱系毒株的10000倍牛半数感染剂量(BID50)攻毒实验,免疫?;ぢ誓艽?00%,半数?;ぜ亮浚≒D50)为10.81~13.59。

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    口蹄疫 重组 疫苗 及其 制备 方法 应用
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