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    广西11选5走势图: 一种混合干细胞注射剂及其制备方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    广西11选5大小走势图 www.fnjpv.tw CN201310302780.0

    申请日:

    2013.07.18

    公开号:

    CN103330720B

    公开日:

    2014.10.01

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 35/44申请日:20130718|||公开
    IPC分类号: C12N5/0775(2010.01)I; C12N5/0789(2010.01)I; A61K35/44; A61P35/02; A61P37/06; A61P37/02; A61P39/00; A61K35/14(2006.01)N 主分类号: C12N5/0775
    申请人: 广州市天河诺亚生物工程有限公司
    发明人: 魏伟; 嵐山芮; 许超
    地址: 510663 广东省广州市萝岗区科学城南云四路1号
    优先权:
    专利代理机构: 广州市华学知识产权代理有限公司 44245 代理人: 黄磊
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201310302780.0

    授权公告号:

    103330720B||||||

    法律状态公告日:

    2014.10.01|||2013.11.06|||2013.10.02

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种混合干细胞注射剂及其制备方法,属于细胞制剂领域。本发明的注射剂是由脐带来源的间充质干细胞和脐血来源的造血干/祖细胞的混合物,其制备方法是从新鲜脐血中分离纯化CD34+的造血干细胞,并与脐带来源的间充质干细胞混合培养扩增,扩增过程培养体系为含体积分数为15%AB脐血浆的培养基及细胞因子,接种6×104个间充质干细胞和5×104个/ml浓度CD34+造血干细胞到培养瓶中,培养10天左右,同时收获两种细胞,制备成含5×105个/ml的造血干/祖细胞和2×105个/ml的间充质干细胞的含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水的混合干细胞注射剂。

    权利要求书

    权利要求书
    1.   一种混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于包括如下步骤:
    (1)脐带间充质干细胞的分离和原代培养:将脐带去掉外层羊膜和剔除血管,去除残余血液,留取沃顿胶质,将沃顿胶质剪成1mm2的组织块,平铺在T25培养瓶底,加入MSC无血清培养基,置于37℃,饱和湿度,浓度5%的CO2条件下培养6~8天,细胞进行换液继续培养;
    (2)间充质干细胞的培养和传代:步骤(1)换液培养3?4天后细胞进行传代,用质量分数为0.25%胰酶消化1分钟,MSC无血清培养基终止消化,500g离心去上清,留取细胞沉淀,用MSC无血清培养基重悬,接种在T75培养瓶中培养,按1:3的比例传代,三天传代一次,取第3代间充质干细胞与造血干细胞共培养;
    (3)脐血造血干细胞的分离和培养:新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,收集细胞沉淀,用含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液再洗一次,离心力200g,离心时间10分钟;离心完后,收集细胞沉淀,用30ml含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液重悬,MiniMACS免疫磁珠分选法从单个核细胞中纯化出高表达CD34+的造血干细胞;分选出的CD34+造血干细胞与间充质干细胞按照15:1的数量比,同时接种在T75培养瓶中,根据得到的CD34+造血干细胞的数量来确定加入特定培养基的体积,确保CD34+造血干细胞接种密度为5×104个/ml,间充质干细胞接种数量6×104个;每个T75培养瓶加入特定培养基的体积不得超过30ml;然后加入特定培养基,放置在37℃,二氧化碳浓度5%的培养箱培养,第6天,分别收集悬浮生长的造血干/祖细胞和贴壁生长的间充质干细胞,造血干/祖细胞与间充质干细胞按照50:1的数量比同时接种在T175培养瓶中,根据扩增后的造血干/祖细胞的数量来确定加入特定培养基的体积,确保造血干/祖细胞密度为1×106个/ml,间充质干细胞接种数量2×106个,每个T175培养瓶加入特定培养基的体积不得超过50ml;然后加入特定培养基,放置在37℃,二氧化碳浓度为5%的培养箱培养,培养4天后收获细胞;
    (4)将步骤(3)制备的造血干/祖细胞和间充质干细胞加入含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水定容至两种干细胞的浓度分别为5×105/ml和2×105/ml,制成混合干细胞注射剂。

    2.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(1)中所述的脐带为无菌采取健康人的脐带。

    3.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(1)和(2)中所述的MSC无血清培养基为Lonza公司的TheraPEAKTMMSCGM?CDTMMedium。

    4.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的新鲜脐血为从脐血采集到制备不应超过4小时。

    5.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的新鲜脐血经Ficoll淋巴细胞分离液分离出单个核细胞的条件为新鲜脐血与生理盐水体积比1:2稀释后,经Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞,离心时间25min,离心力500g,离心加速度为7,减速度为2;温度20℃,离心结束后,取白膜层;加入3倍体积的生理盐水,洗涤一次,离心力600g,离心10min,收集细胞沉淀。

    6.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的含有EDTA和人血清白蛋白的PBS缓冲液为美天旎公司的CliniMACS PBS/EDTA Buffer。

    7.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的MiniMACS免疫磁珠分选法:经两次过LS分选柱,分选出的CD34+造血干细胞的纯度达到90%以上。

    8.   根据权利要求1所述的混合干细胞注射剂的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的特定培养基包含IMDM培养基、体积分数为15%人AB脐血浆、体积分数为0.04%低分子肝素钙、20ng/ml IL?6、20ng/ml IL?3、50ng/ml SCF、50ng/ml Flt?3L和20ng/ml TPO细胞因子。

    9.   权利要求1~8任一项所述的制备方法获得的混合干细胞注射剂,其特征在于为含5×105个/ml的造血干/祖细胞和2×105个/ml的间充质干细胞的含有体积分数为5%AB脐血浆的生理盐水注射剂。

    关 键 词:
    一种 混合 干细胞 注射 及其 制备 方法
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